الیسیتورهای گیاهی: گیاهان دارویی به عنوان سرمایه های ژنتیکی ارزشمند در شمار میراثهای بومی کشورها محسوب می‌شود و دارای اهمیت جهانی هستند. این گیاهان در طول تاریخ جز منابع اصلی پزشکی و داروسازی در اکثر نقاط جهان بوده اند. امروزه برای درمان و حفظ سلامتی انسان تأکید زیادی بر استفاده از داروهایی با منشا طبیعی می‌شود. داروهای گیاهی به دلیل نزدیکی و سازگاری با فیزیولوژی بدن انسان در مقایسه با داروهای شیمیایی خطرات و عوارض جانبی کمتری دارند. این ویژگی یکی از دلایل اصلی رویکرد و تمایل دوباره مردم جهان به گیاهان دارویی و استفاده از آنها در قیاس با داروهای شیمیایی و مرکب از مواد مصنوعی (Synthetic) شده است .
این گیاهان، به ترکیباتی بهنام متابولیتهای ثانویه نسبت داده می‌شود .متابولیتهای ثانویه ترکیباتی هستند که تنها از متابولیتهای اولیه (متابولیتهای مربوط به تغذیه و بقا) که برای حفظ حیات موجود ضروری هستند تولید می‌شود. نشان داده شده است که این محصولات ثانویه برای گیاهان و جانورانی که آنها را سنتز می‌کنند بسیار مفیدند. متابولیتهای ثانویه منحصر به گونه یا حتی نژاد خاص بوده و اغلب طی یک دوره خاص رشد و نمو در گیاه تولید می‌شود. این ترکیبات دارای عملکردهای اکولوژیکی مهم در گیاهان هستند و نقش حفاظتی در مقابل گیاهخواران و عوامل بیماریزای میکروبی و همچنین جذب گرده افشانها ایفا می‌کنند. این ترکیبات به گروههای مختلفی از جمله آلکالوئیدها، آنتوسیانینها، فلاونوئیدها، کوئینونها، استروئیدها و ترپنوئیدها تقسیم می‌شود و کاربردهای تجاری متنوعی به‌عنوان دارو، رنگ، حشرهکش و چاشنی از نقطه نظر طعم، بو و غیره دارند.
بر اساس برخی از گزارشها تاکنون حداقل 100/000 متابولیت ثانویه از 50/000 گونه گیاهی شناسایی شده است و هرسال نیز 4000 متابولیت جدید از گونه‌ها و واریتههای مختلف گیاهی کشف می‌شود. برخی از این ترکیبات مانند دیجیتوکسین، شیکونین، عطر جاسمین و داروهای ضد سرطان مانند وینبلاستین، وینکریستین و تاکسول از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند و قیمت آنها از چند دلار تا چند هزار دلار بهازای هر کیلوگرم تغییر میکند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از طریق روشهای طبیعی عمدتا مشکل و یا تقریبا غیرممکن است و از سوی دیگر محدودیتهای مختلف مانع تأمین این مواد از طبیعت می‌شود. با توجه به این که بهطور طبیعی سرعت تولید متابولیتهای ثانویه غالبا بسیار کند بوده و مستلزم مدت زمان طولانی است، استفاده از روشهای بیوتکنولوژی برای تولید سریع و انبوه متابولیتهای ثانویه و مواد دارویی گیاهی امری ضروری به نظر میرسد.
با وجود اینکه متابولیتهای ثانویه بسیار متنوعند، اما تعداد مسیرهای اصلی بیوسنتزی آنها محدود و مشخص است. پیشمادههای ساختاری متابولیتهای ثانویه به‌عنوان منابع تولید این متابولیتها در سه مسیر اصلی شامل مسیرهای استات ـ مالونات، استات ـ موالونات و اسید شیکمیک وارد می‌شود. سه گروه از محصولات ثانویه براساس ویژگی‌های بیوسنتزی وجود دارند که به ترپنها، ترکیبات فنولی و ترکیبات نیتروژندار تقسیم می‌شود.
ترپنها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه محصولات ثانویه را شامل می‌شود. مواد متنوع این گروه معمولا در آب غیرمحلولند. ترپنها از پیوستن واحدهای پنج کربنی ساخته شده از طریق مسیر موالونیک اسید تشکیل می‌شود. بیشتر ترپنها اعمال مشخصی در رشد و نمو گیاه به عهده دارند. به عنوان مثال پیش ماده آبسزیک اسید، یک سزکوئیترپن است. استروئیدها مشتقات تری‌ترپنها بوده و از اجزای ضروری غشای پلاسمایی بهحساب میآیند. بدین ترتیب بعضی از ترپنها نقشهای اولیه مهمی در گیاه به عهده دارند. این مواد سمی بوده و در بسیاری از گیاهان به عنوان ترکیبات دفاعی ضدگیاهخواری ایفای نقش می‌کنند.
در ساختمان بسیاری از محصولات ثانویه گیاهان نیتروژن وجود دارد. این ترکیبات شامل آلکالوئیدها و گلیکوزیدهای سیانوژنیک میباشند. آلکالوئیدها محصولات طبیعی هستند که در ساختمان خود دارای نیتروژن بوده و معمولاً ساختار حلقوی دارند. بسیاری از داروهای رایج بر پایه ترکیبات آلکالوئیدی شکل گرفتهاند که از جمله آنها مسکالین (Mescaline)، نیکوتین (Nicotine)، کوکائین (Cocaine) و مورفین (Morphine) میباشند. گلیکوزیدهای سیانوژنیک و گلیکوزینولیتها نیز گروهی دیگر از ترکیبات نیتروژندار را شامل می‌شود. آمیگدالین (Amygdaline) و پروناسین (Prunasin) از مهمترین گلیکوزیدهای سیانوژنیکی هستند که در خانواده گندمیان (Poaceae) و گلسرخ (Rosaceae) قرار دارند.
گیاهان طیف وسیعی از محصولات ثانویه را تولید می‌کنند که دارای یک گروه فنولی بوده و بهنام ترکیبات فنولی طبقه‌بندی می‌شود و شامل فنولهای ساده، لیگنینها، فلاونوئیدها و تاننهای فشرده میباشند. باتوجه به تنوع زیاد شیمیایی، ترکیبات فنولی نقشهای متفاوتی را در گیاهان بازی می‌کنند. در گیاهان اکثر ترکیبات فنولی از فنیلآلانین و تیروزین مشتق شدهاند. از متابولیتهای ثانویه این گروه میتوان به مشتقات فنیلپروپان ساده مثل اسید فرولیک (Ferulic acid) و اسید کافئیک (Caffeic acid)، کومارینها مثل آمبلیفرون (Umbeliferon) و سورالن (Psoralen)) و مشتقات اسید بنزوئیک نظیر اسید سالیسیلیک و وانیلین (Vanillin) اشاره نمود .
امروزه بیوتکنولوژی گیاهان دارویی به‌عنوان ابزاری نوین برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه بهکار گرفته می‌شود که از طریق انتخاب، ازدیاد در شرایط درون شیشهای (in vitro)، نگهداری ژنوتیپهای در حال انقراض توسط روشهای حفاظت انجمادی (Cryopreservation) و تولید گیاهان تراریخت صورت میگیرد. کشت سلول گیاهی (Plant cell culture) و کشت اندام (Organ culture) که شامل کشت جوانه، جنین، ساقه، ریشه و ریشههای مویین می‌باشد از جمله روشهای بیوتکنولوژی هستند که بهمنظور تولید متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار گرفتهاند. با این حال، بهدلیل عدم تمایز بافتهای کشت شده در اغلب کشتهای سوسپانسیون سلولی (کشت سلولهای معلق در محیط مایع)، مقدار تولید متابولیتهای ثانویه در این سیستم کم است و برخی متابولیتها نیز فقط در بافتهای خاص دارای تمایز مورفولوژیکی تجمع مییابند. لذا تولید متابولیتهای ثانویه با استفاده از تکنولوژی کشت بافت گیاهی هنوز دچار محدودیتهای بیولوژیکی و بیوتکنولوژیکی است. بههمین منظور روشهای متعددی برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در کشت بافت استفاده می‌شود که عبارتند از:
بسیاری از اجزای محیط کشت تعیین کننده رشد سلول و تولید متابولیتها می‌باشد. بهینه کردن نوع و غلظت هورمونهای گیاهی غالبا موثر بوده و تغییر فاکتورهای محیطی چون سطوح موادغذایی، نور و منبع کربن نیز ممکن است در افزایش تولید تاثیرگذار باشند. همچنین منبع نیتروژن می‌تواند در عملکرد محصول نقش با اهمیتی داشته باشد. برای نمونه کاهش سطح آمونیوم و افزایش میزان نیترات، تولید آرتمیزین را در ریشههای موئین گیاه گندواش یا خاراگوش شیرین (Artemisia annua) تقویت کرده و مقادیر بالای نیتروژن نیز موجب بازدارندگی رشد و تولید این گیاه می‌شود.
در بیشتر موارد محصولات تشکیل شده در سیستم سوسپانسیون سلولی در واکوئل سلول ذخیره می‌شود. برای اینکه این محصولات از واکوئل سلولهای گیاهی خارج شوند باید از دو غشای پلاسمایی و تونوپلاست عبور کنند. کارهای زیادی انجام شده است تا سلول گیاهی را برای مدتی کوتاه نفوذپذیر کند، به گونه‌ای که سلول توانایی خود را حفظ نموده و مقدار انتقال متابولیتها از سلول افزایش یابد. نفوذپذیری غشا به تشکیل منافذ در یک یا بیشتر سیستمهای غشایی سلولهای گیاهی که عبور مولکولها را به داخل و خارج سلول ممکن سازد بستگی دارد. نفوذپذیری سلولها را میتوان به وسیله اندازه گرفتن آنزیمهای متابولیسم اولیه شامل هگزوکیناز، گلوکز 6 فسفات دهیدروژناز، ایزوسیترات دهیدروژناز و مالیک و سیترات سینتتاز کنترل کرد. دامنه گستردهای از عوامل نفوذپذیرکننده برای افزایش تحریکپذیری و رها سازی محصولات ذخیره شده در درون سلول به محیط کشت اضافه می‌شود. انواع نمک‌ها، حلالهای آلی مثل ایزوپروپانول و دیمتیلسولفوکساید، پلیساکاریدهایی چون کیتوزان و سطح دهنده‌هایی نظیر توئین20 به عنوان عوامل نفوذپذیرکننده استفاده شدهاند. روشهایی مثل اولتراسونیک و الکتروپوریشن نیز برای القای نفوذپذیری سلولها بهکار گرفته شده اند.
کاربرد مهندسی متابولیک
مهندسی متابولیک به طور معمول به عنوان تکنیکی برای هدایت یک یا چند واکنش آنزیمی به منظور تولید ترکیبات جدید در سلول و بهبود تولید ترکیبات خروجی تعریف می‌شود. مهندسی متابولیک همچنین به استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای اصلاح فعالیتهای درون سلولی از طریق دستکاری عملکردهای آنزیمی و تنظیمات داخلی سلول اطلاق می‌شود. قسمت اعظمی از تحقیقات در زمینه متابولیتهای ثانویه، روی شناسایی و دستکاری ژنتیکی آنزیمهای دخیل در مسیر متابولیکی سنتز یک متابولیت ثانویه، متمرکز شده است. ابزار طبیعی که در فرآیند مهندسی ژنتیک و در اکثر گونه‌های گیاهی و بخصوص گیاهان دولپه به کار میرود، یک باکتری خاکزی بهنام آگروباکتریوم تیومفاسینس (Agrobacterium tumefacience) است. تولید متابولیتهای ثانویه عموما تحت کنترل بیش از یک ژن می‌باشد. اگرچه تحقیقات فراوانی طی سی سال گذشته در زمینه تولید متابولیتهای ثانویه انجام شده است، لیکن به دلیل فقدان اطلاعات پایه در رابطه با مسیرهای بیوسنتزی تولید مواد مذکور و کنترل چند آنزیمی این مسیرها و همچنین عدم آشنایی و دسترسی کافی به بیورآکتورها، تولید اقتصادی آنها به جز در موارد خاص امکانپذیر نشده است.
در بیوسنتز مونوترپنها در گیاه آویشن (Thymus vulgaris) و نعناع فلفلی (Mentha piperita)، یک سیستم چندژنی با برهمکنش اپیستاتیک (برهمکنش ژنهای غیرآلل) نقش دارد، اما در پونه آبی (Mentha aquatica) همه ژنهای دخیل در مسیرهای بیوشیمیایی مونوترپنها به صورت دو آللی با وراثت ساده غالب و مغلوبی است. بنابراین مهندسی ژنتیک می‌تواند به عنوان ابزاری قدرتمند جهت تولید متابولیتهای ثانویه جدید و همچنین افزایش مقدار متابولیتهای ثانویه موجود در یک گیاه به کار گرفته شود.
پلیپلوئیدی به افزایش تعداد سری کروموزومهای یک موجود تا چند برابر تعداد کروموزومهای اصلی (X) آن گفته می‌شود. پلی پلوئیدی مکانیسم‌هایی را در سلول فعال کرده و در نتیجه میزان DNA الگو و بهدنبال آن نسخه برداری و ترجمه نیز تحت تاثیر قرار گرفته و منجر به افزایش، کاهش و حتی خاموشی برخی ژنها می‌شود، و به این صورات بسیاری از صفات فیزیولوژیکی و ریخت شناسی گیاه را تحت تاثیر قرار میدهد.
اگرچه پلیپلوئیدی مصنوعی به‌عنوان روشی برای اصلاح گیاهان زراعی به‌کاربرده شده است، اما در مورد گیاهان دارویی نیز برای افزایش متابولیتهای ثانویه در گیاهان اصلاح شده بهکار میرود. غالب گیاهان تتراپلوئید به‌خاطر داشتن تعداد کروموزومهای دوبرابر، اندازه بزرگتری دارند و از آنها متابولیت ثانویه بیشتری بهدست می‌آید. برای مثال در گیاه گندواش، ریشههای موئین تتراپلوئید ایجاد شده در مقایسه با ریشههای موئین دیپلوئید پنج برابر آرتمیزین تولید کردهاند. با اینحال افزایش سطح پلوئیدی در گیاهان همواره تولید متابولیتهای ثانویه را ارتقا نداده بلکه در مواردی باعث کاهش آنها نیز شده است. بهطور مثال این پدیده در یکی از گونه‌های داتوره (Datura innoxia) دیده شده است.
الیسیتور (Elicitor) از ریشه Elicit به معنای بیرون کشیدن یا استخراج کردن مشتق گردیده و معادل “استخراج‌گر” یک واژه تعریف شده علمی برای فاکتورهایی است که بهطور مستقیم یا غیر مستقیم تغییرات دفاعی قابل القا را در سیستم گیاهی مورد هدف قرار میدهد و منجر به فعال سازی دستهای از مکانیزمهای دفاعی و بیوسنتز مواد شیمیایی مفیدی می‌شود که در سازگاری گیاهان نسبت به شرایط پرتنش گیاه نقش اساسی دارند. بهطور خلاصه الیسیتورها محرکهای فیزیکی یا ترکیبات شیمیایی با منشا زیستی و غیرزیستی هستند که میتوانند پاسخهایی را در گیاه القا کنند که باعث سنتز و تجمع متابولیتهای ثانویه مشابه و جدید در سلولها شوند. الیسیتورها برای گیاه یکسری از پیامهای شیمیایی را میفرستند که سبب رها شدن پاسخهای فیزیولوژیکی و مرفولوژیکی و تجمع فیتوالکسین می‌شود. طی پاسخ به سیگنال الیسیتور، سیستم دفاعی گیاه فعال می‌شود و در نتیجه بیان ژنهای دفاعی، متابولیتهای ثانویه تجمع مییابند. کاربرد الیسیتورها بهمیزان محدود و در غلظتهای پایین، بیوسنتز ترکیبات خاصی را در سیستم سلولی زنده تحریک یا بهبود بخشیده و بهطور کلی زمان دستیابی به مقادیر بالای متابولیتها را کاهش میدهد.
استخراجگری (Elicitation) تقریبا موثرترین راهکار عملی برای افزایش تولید ترکیبات ثانویه مطلوب در سیستمهای گیاه، اندام و سلول است. الیسیتورها ممکن است ژن جدیدی را فعال کنند که می‌تواند آنزیمها و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه اندازی نموده و باعث تشکیل متابولیتهای ثانویه شود. شروع پاسخهای دفاعی در گیاه شبکهای از انتقال سیگنال (Signal transduction) را القا میکند که با تشخیص الیسیتور توسط پذیرندههای سطح سلول شروع می‌شود .
استفاده از الیسیتورها در پژوهشهای مربوط به زیست فناوری متابولیتهای ثانوی گیاهی دو هدف اصلی را دنبال میکند: نخست کسب یافته هایی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که منجر به تشکیل و تنظیم متابولیتهای ثانوی می‌شود. دوم افزایش تولید متابولیتهای ثانوی برای کاربرد تجاری.
در منابع مختلف تقسیم بندیهای متفاوتی برای الیسیتورها آمده است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود.
الیسیتورهایی هستند که از مواد ترشح شده به بیرون سلول مانند پلیساکاریدها، پلی آمینها و اسیدهای چرب به دست میآیند.
شامل مواد ترشح شده از درون سلول مانند گالاکتورونید و هپتا ـ بتا ـ گلوکوزید هستند.
الیسیتورها بر اساس برهم کنش الیسیتور گیاه به دو گروه الیسیتورهای عمومی و الیسیتورهای ویژه نژادی تقسیم بندی می‌شود. الیسیتورهای عمومی باعث القا پاسخهای دفاعی هم در گیاه میزبان و هم در گیاه غیرمیزبان می‌شود، در حالیکه الیسیتورهای ویژه نژادی پاسخهای دفاعی مقاومت به بیماری را تنها در میزبانهای ویژه بسته به حضور همزمان ژنهای غیربیماریزا (Avirulence Genes “avr genes”) در پاتوژن و ژنهای مقاومت (Resistance Genes “R genes”) در گیاه القا می‌کنند.
در دیگر دسته بندی رایج، الیسیتورها براساس طبیعت‌شان به الیسیتورهای زیستی (Biotic) و الیسیتورهای غیرزیستی (Abiotic) طبقه‌بندی می‌شود:
الیسیتورهای زیستی مولکولهایی از پاتوژنها یا خود میزبان میباشند که میتوانند باعث القای پاسخهای دفاعی شوند. این مولکولها به ترکیباتی اطلاق می‌شود که بهوسیله عمل آنزیمهای گیاهی روی دیواره سلولی میکروارگانیسمها ساخته می‌شود. الیسیتورهای زیستی همچنین شامل ترکیبات طبیعی هستند که به وسیله سلولهای گیاهی در پاسخ به تحریک کنندههای مختلف تولید می‌شود. به‌عنوان نمونه میتوان از عصاره مخمر، ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره سلولی، الیگوساکاریدها، پروتئینها، گلیکوپروتئینها و اسیدهای چرب نام برد .
الیسیتورهای غیرزیستی شامل پرتو فرابنفش، فلزات سنگین، ترکیبات غیرضروری محیط کشت و بسیاری از موارد دیگر میگردند. الیسیتورهای غیرزیستی تحریک کنندههای تولید فیتوآلکسینها بوده و از آنها در گیاهان زیادی به منظور افزایش متابولیتهای ثانویه استفاده گردیده است. در این مقاله افزایش تولید برخی از متابولیتهای ثانویه در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی مورد بررسی قرار میگیرد.
الیسیتوربرای یک گیاه به‌عنوان محرک عمل میکند که می‌تواند پاسخهای فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و تجمع فیتوالکیسنها را در گیاه باعث شود. بهخوبی معلوم شده است که تیمار گیاهان با الیسیتورهامشابه حمله پاتوژنهای ناسازگار موجب بروز آرایشی از عکس العملهای دفاعی، از قبیل تجمع مجموعهای از متابولیتهای ثانویه دفاعی در گیاه سالم یا در کشتهای سلول گیاهی می‌شود. مکانیسم دقیق تحریک هنوز بهطور کامل شناخته نشده است، اما مکانسیمهای مختلفی در این خصوص مانند کلسیم پیک، فاکتورهای موثر در پیوستگی غشا سلول، ممانعت یا فعالیت مسیرهای بین سلولی و تغییرات در استرس اسموتیکی پیشنهاد شدهاند. بعضی محققان فرض کردهاند که الیسیتورهابه یک گیرنده غشای پلاسمایی برای فرآیند تحریک متصل می‌شود. کنشهای اصلی در تحریک سلول توسط الیسیتورها، اتصال به گیرنده‌های پروتئینی خاص در غشای پلاسمایی، کاهش pH سیتوزول و تولید گونه‌های اکسیژن واکنشگر و در نهایت فعال شدن رونویسی از ژنهای دخیل در فرآیندهای پاسخ دفاعی سلول است .
انتقال الیسیتورها یا سیگنالها در سلولهای گیاهی می‌تواند مکانیسمهای سودمندی در تولید متابولیتهای ثانویه را القا کند. در این مکانیسمها پیامبرهای ثانویهای تولید می‌شود که منجر به فعالسازی آبشارهای پروتئین کیناز می‌شود که آنها نیز بهنوبه خود قادرند توانایی بیوسنتزی تولیدات گیاهی خاصی را فعال کنند. یک مکانیسم ممکن است برای تحریک زیستی در گیاهان براساس میانکنش‌های گیرنده الیسیتور خلاصه شود. زمانیکه گیاه یا سلول گیاهی توسط الیسیتور تحریک می‌شود، دستهای از واکنشهای بیوشیمیایی در چندین مرحله اتفاق میافتند که در زیر اشاره می‌شود.
1- اتصال الیسیتور به گیرنده غشای پلاسمایی
2- تغییر در جریانات یونی در طول غشا: جریان یونهایK، Cl و Ca از فضای خارج سلول یا از ذخایر درون سلولی به سیتوپلاسم
3- تغییر سریع در الگوهای فسفریلاسیون پروتئینی، فعالیت پروتئین کیناز، فعالیت پروتئین G و تحریک پروتئین کیناز فعال شده میتوژن (Mitogen Activated Protein Kinase)
4- سنتز فسفولیپازهای A، C و D (PLA، PLCو PLD) و تولید پیامبرهای ثانویه، اینوسیتول 1 و4 و 5 تری فسفات (Inositol 1,4,5 triphosphate) و دیاسیلگلیسرول (Diacylglycerol) که از طریق آزادسازی Ca درون سلولی و مسیر سیگنالی، اکتادکانوئید و نیتریکاکساید را واسطهگری می‌کنند.
5- تولید گونه‌های اکسیژن واکنشگر مانند یون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن که ممکن است دارای اثرات مستقیم ضدمیکروبی باشند و نیز منجر به تولید مشتقات اسیدچرب فعال زیستی شوند و در اتصال عرضی پروتئین‌های غنی از پرولین متصل به دیواره سلول شرکت کنند. پراکسید هیدروژن می‌تواند به‌عنوان یک پیام رسان ثانویه عمل کند و در فعال سازی رونویسی ژنهای دفاعی نقش داشته باشد.
6- اسیدی شدن سیتوپلاسم در اثر غیر فعال شدن H+-ATPase، کاهش در قطبیت غشا و افزایش pH خارج سلولی
7- فعال سازی NADPH اکسیداز که باعث تولید ROS و اسیدی شدن سیتوسول می‌شود.
8- سازماندهی مجدد غشای سلولی
9- تجمع پروتئین‌های مربوط به دفاع یا پروتئین‌های مربوط به بیماریزایی مانند کینازها، گلوکونازها، اندوپلیگالاکتورونازهایی که منجر به آزاد سازی الیگومرهای پکتیکی پیام دهی می‌شود، گلیکو پروتئین‌های غنی از هیدروکسی پرولین و بازدارندهای پروتئازی
10- واکنش حساسیت فوق‌العاده (Hypersensitivity) و مرگ سلولی
11- تغییرات ساختمانی در دیواره سلولی (چوبی شدن دیواره سلولی، رسوب کالوس)
12- فعالیت رونویسی ژنهای مربوط به پاسخ دفاعی مانند فنیلآلانین آمونیالاز (Phenylalanine Ammonialyase)، گلوتاتیون ترانسفراز (Glutathione S-transferase) و چالکون سنتاز (Chalcone Synthases). ضمناً مولکولهای دفاعی گیاه مانند تاننها و فیتوالکسین 4-2 بعد از تحریک توسط محرک کشف شدهاند.
13- سنتز اسید جاسمونیک و اسید سالیسیک به‌عنوان پیامرسانهای ثانویه
14- مقاومت اکتسابی سیستمیک (Systemic Acquired Resistance)
آنچه مشخص شده این است که الیسیتورها از طریق گیرنده‌های موجود در غشای پلاسمایی دریافت می‌شود و از طریق سیستمهای سیگنالینگ نسخهبرداری و ترجمه (بیان) ژنهای دخیل در بیوسنتز متابولیتها را تحت تاثیر قرار میدهند.
نمونه‌هایی از کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی در تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی
عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن سلولها، نوع محیط کشت، زمان در معرض قراردهی یا افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که محیط کشت در معرض الیسیتور قرار میگیرد، بر تولید متابولیتهای ثانویه تاثیر میگذارند. در بین الیسیتورهای غیرزیستی، الیسیتورهایی که در مقیاس نانو بهمنظور تولید متابولیتهای ثانوی در کشت سلولهای گیاهی بهکار رفته‌اند دارای جایگاه ارزشمندی میباشند.
بهمنظور تولید سنگوئینارین و تبائین در سوسپانسیون سلولی مریستم و ریشه گیاه خشخاش از نانو دیاکسیدتیتانیوم استفاده شد که نتایج حاصل از آن طی 24 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش دو آلکالوئید مزبور را تا 1/2 برابر نسبت به شاهد نشان داد. همچنین جهت تولید آلوئین در گیاه آلوئهورا از دو نانوالیسیتور نقره و دیاکسیدتیتانیوم استفاده شد و نتایج حاکی از آن بود که دو نانوالیسیتور مذکور طی 48 ساعت پس از اعمال تیمار بهترتیب باعث افزایش آلوئین بهمیزان 7/43 و 6/11 درصد شدند، اما پس از آن تولید آلوئین تا رسیدن به سطح کنترل کاهش نشان داد. اثر نانو نقره بر تقسیم سلولی و شاخصهای میتوزی که خود بر میزان تولید متابولیتها موثر می‌باشد نیز مورد بررسی قرارگرفته است. در این رابطه محققین از گونه‌های گیاهی جنس Allium استفاده کردند و دریافتند که نانونقره بهصورت معنیداری شاخص میتوزی را کاهش و دگرگونی ساختاری در کروموزوم را افزایش داد.
اگرچه نانو ذرات بهراحتی به سیستم بافت گیاهی نفوذ کرده و روی میزان تولید متابولیتهای ثانویه تاثیر مثبت میگذارند، اما در غلظتهای بالا و حضور طولانی مدت در محیط، بهواسطه کاهش شاخص میتوزی و آزاد کردن یونهای سمی باعث ایجاد مسمومیت سلولی (cytocyctic) می‌شود. چنانکه پیشتر گفته شد، الیسیتورها در محیط کشت از طریق فعال کردن ژنهای مربوط به مکانیسمهای دفاعی باعث القای تشکیل متابولیتهای ثانویه می‌شود، اما پس از آن پاسخ سلولی نسبت به حضور الیسیتورها (نانوالیسیتورها) منفی بوده و با از بین رفتن نیروی محرک پروتونها (Proton-motive force) در عرض غشا، ناپایدار شدن غشا خارجی و آزاد کردن گونه‌های اکسیژن واکنشگر همراه است. گونه‌های اکسیژن واکنشگر تولید شده ممکن است جزئی از مکانیسم سمیت ژنی (Genotoxic) نانو الیسیتورها باشد که به صورت مستقیم پروتئینها را تخریب کرده و یا آنها را برای تجزیه حساس میکند. در صورت حضور طولانی مدت نانوالیسیتورها در محیط، گونه‌های اکسیژن واکنشگر روی DNA اثر مخرب داشته و منجر به کاهش تولید مواد موثره می‌شود.
تابش پرتو فرابنفش بهطور معنیداری باعث افزایش تولید رسوراترول در برگ و میوه و کالوس حاصل از آنها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور گردیده است.
استفاده از اسید سالیسیلیک و محرکهای قارچی روی تولید تاکسول در سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار (Taxus bacata) موثر بوده است. نتایج مطالعات در این خصوص نشان داده است که ترکیب اسید سالیسیک و محرک قارچی روی بیوماس سلولهای گیاه مزبور تاثیر نداشته، اما موجب تولید بیشترین میزان تاکسول شدهاند. همچنین در آزمایش دیگری با افزودن پیشمادههای موالونات و ان-بنزوئیل گلیسین به کشت سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار میزان تولید تاکسول تا 3 برابر افزایش یافت.
تولید 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در کشت سلول یکی از گونه‌های وحشی جنس کتان (Linum nodiflorum) تحت تاثیر متیل جاسمونات بهمیزان ده برابر افزایش یافت. کاربرد متیل جازمونات همچنین توانسته است تولید رسوراترول را در برگ و میوه و کالوس حاصل از آنها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور بهمیزان قابل توجهی افزایش دهد.
نیترات نقره (AgNO) و کلرید کادمیوم (CdCl) موجب تحریک تولید تروپانآلکالوئیدهای اسکوپولامین و هیوسیامین از طریق کشت ریشههای موئین گیاه تاتوره معطر (Bragmansia candida) شده و باعث افزایش تولید این آلکالوئیدها شدهاند.
در آزمایشی از سطوح مختلف نیتروژن و بنزیل آدنین بهمنظور تولید آلوئین از گیاه آلوئهورا استفاده شد و پس از 12 ماه میزان آلوئین نه تنها با کاربرد هر یک از دو الیسیتور فوق بهتنهایی افزایش یافت، بلکه کاربرد همزمان آنها نیز دارای اثرات متقابل مثبت بود و موجب افزایش بیشتر میزان آلوئین شد.
گزارشها نشان دادهاند که با اضافه کردن قندها بهمنظور بهینهسازی عناصر غذایی محیط کشت، میزان تولید متابولیت ثانویه بالا رفته است. در این رابطه، وقتی بهجای 5/2 درصد ساکارز در کشت سلولی گیاه حسن یوسف بهمیزان 5/7 درصد استفاده شد، عملکرد رزمارینیک اسید معادل 4 برابر افزایش یافت.
بهدلیل اهمیت اقتصادی و افزایش تقاضا برای تولید متابولیتهای ثانویه، محققین بهدنبال روشهایی برای تولید هرچه بیشتر و با کیفیتتر این ترکیبات هستند. بیوتکنولوژی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت و اندامهای گیاهی و بهرهگیری از الیسیتورها امکان تولید سریع و انبوه متابولیتهای با اهمیت را فراهم میسازد. استفاده از الیسیتورها روش مناسبی به منظور تولید هر چه بیشتر متابولیتهای ثانوی در شرایط درون شیشهای می‌باشد. بهنظر میرسد ترکیبات فعال الیسیتورها نقش موثری در القای پاسخهای دفاعی و افزایش تولید متابولیتهای ثانوی دارند. الیسیتورها بیان ژن را در گیاهان تحت تاثیر قرار داده و با از بین بردن سدهای مهارآنزیمی یا دستکاری مسیر آنزیمها باعث تغییر در سطح تولید متابولیتها میگردند. همچنین از این طریق میتوان سطح آنزیمهای موثر در مسیر بیوسنتز را اندازهگیری و جهت کنترل مسیرهای بیوسنتز آنها را شناسایی کرد و روشهای جدیدی در کنترل و تولید متابولیتها ارائه نمود.
